Suele suceder con las revoluciones que sus protagonistas casi nunca son conscientes de ellas. Probablemente ni los colonos que arrojaron el té inglés a las aguas del puerto de Boston en 1773 ni los parisinos que asaltaron la Bastilla pocos años después pensaron que aquello era algo más que un tumulto. Probablemente no sospecharon que estaban cambiando la Historia. Con las revoluciones científicas a veces sucede lo mismo. Es posible que desde hace unos pocos años estemos viviendo una casi sin darnos cuenta. Por eso podría llamarse ?silenciosa?. Por eso, y también porque se basa en los sistemas de silenciamiento génico o ¿interferencia por RNA? (RNAi), un recientemente descubierto mecanismo de control de la expresión génica que se ha revelado universal en los eucariotas y que podríamos utilizar con objetivos científicos y terapéuticos.
La historia comenzó hace tan sólo seis años, cuando un grupo de embriólogos del Instituto Carnegie de Washington estaba estudiando en Caenorhabditis elegans la interferencia que se produce en la expresión génica mediante la introducción de RNA antisentido en las células [Fire et al., Nature 391:806-1 l(1998)]. Desde 1990, y gracias a estudios en las plantas, se conocía que la unión de moléculas antisentido de DNA o RNA al mRNA bloqueaba su traducción. Lo original del estudio del grupo del Carnegie consistió en introducir en las células RNA de doble cadena (es decir, sentido y antisentido hibridados). La sorpresa debió ser grande cuando comprobaron que el efecto de silenciamiento génico era mucho más potente que con RNA de cadena sencilla, contra lo que cabría esperar. Aún más sorprendente fue constatar que la estequiometría del proceso no coincidía con la idea de un simple bloqueo del mRNA por hibridación. Unas pocas moléculas de RNA de doble cadena bastaban para silenciar la expresión génica a pesar de la cantidad mucho mayor de mRNA existente en la célula. Los autores ya apuntaron a la existencia de un mecanismo amplificador o catalítico de naturaleza desconocida.
Aunque el silenciamiento génico presenta diferencias en animales frente a hongos y plantas, el proceso y sus ?actores? moleculares son básicamente los mismos. La vía normal, fisiológica, de silenciamiento comienza cuando se expresa un un pre-miRNA (precursor micro-RNA), una cadena sencilla que puede plegarse y formar una horquilla de doble cadena denominada miRNA. Otra posibilidad es la aparición de RNA de doble cadena que puede proceder de virus o transposones. En ambos casos estas cadenas dobles de RNA son cortadas por una enzima denominada Dicer en pequeños fragmentos (19 a 24 nt) de doble cadena con extremos 3? salientes (2-3nt) denominados siRNAs (short interfering RNA). La caracterización de Dicer [Bernstein et al., Nature 409:363-6 (2001)] permitió identificarla como una RNAsaIII así como localizar en su estructura un dominio de unión a RNA de doble cadena.
Los siRNA producidos por Dicer se asocian con un complejo denominado RISC (RNA-induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoproteico resultante se une al mRNA diana. Si la complementriedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa la traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso. Esto es lo que explica que un número pequeño de moléculas de siRNA puedan destruir un número mucho mayor de mRNA.
El estudio de las vías de silenciamiento génico mediadas por miRNA ha permitido descubrir nuevos e inesperados fenómenos que aún no se conocen en profundidad. Uno de los más sorprendentes es el del RNAi transitivo, que se ha observado en plantas, hongos y C. elegans. Este fenómeno consiste en que la molécula de siRNA provoca, tras el corte del mRNA diana, la síntesis de nuevos siRNA a partir de secuencias que están en dirección 5’ del punto de corte, con lo que se amplifica la señal . El fenómeno necesita RNA polimerasas dirigidas por RNA, un tipo de enzimas que, aparentemente, no existen ni en Drosophila ni en el genoma humano. Esto es importante por razones que veremos luego.
Hasta hace muy poco se pensaba que RISC era un complejo multiproteico de componentes desconocidos. Los análisis señalaban la familia de proteínas Argonauta, una familia muy conservada en todos los eucariotas, cuyos miembros se presentan en un numero variable en cada especie. Era conocido que algunas mutaciones en los integrantes específicos de esta familia causaban defectos en procesos también específicos y en ocasiones muy interesantes. Es el caso de uno de los más conocidos representantes de las Argonautas, la proteína Piwi de Drosophila, fundamental para la generación de las señales moleculares que se generan en el nicho de las GSC (germ-line stem cells) [Lin y Spradling, Development 124:2463-76 (1997)]. En éste y en muchos de estos procesos se descubrió que la alteración se producía en procesos específicos de silenciamiento. Sin embargo no se pudo determinar cuál era el papel real de las Argonautas en el proceso, hasta que en septiembre de 2004 la revista Science publicó la estructura tridimensional de un homólogo de Piwi [Joshua-Tor et al., Science 305:1434-7. (2004)]. Estos autores mostraron la homología estructural entre un dominio común de las Argonautas, el dominio Piwi, y un dominio de una RNAsa, la ribonucleasa H, concluyendo que los integrantes de la familia Argonauta eran precisamente los RISC, al menos en sus actividades más importantes, lo cual no descarta la posibilidad de que participen otros péptidos con funciones accesorias.
El número de la revista Nature de la semana del 11-17 noviembre 2004 dedica una atención especial al tema RNAi, incluyendo una estupenda animación sobre el silenciamiento génico (http://www.nature.co...nai/animations/). Incluye dos artículos en los que se profundiza en los mecanismos de génesis y procesamiento de los miRNA. En ellos se pone de manifiesto la existencia de dos complejos multiproteicos, uno formado por RNA-helicasas, proteínas asociadas a RNA y otras ribonucleoproteínas, y otro complejo denominado ?microprocesador? al que pertenecen las proteínas Drosha (una RNasa tipo III) y Pasha. [Denli et al., Nature 432:231-235 (2004); Gregory et al., Nature 432:235-240 (2004)]. El complejo microprocesador, situado en el núcleo celular, reconoce y corta los transcritos primarios denominados ?miRNA primitivo? que pueden tener una longitud comprendida entre varios cientos y varios miles de bases. Así se generan los miRNA, cadenas en horquilla de unos 70 nucleótidos que serán procesados por Dicer.
Las funciones fisiológicas conocidas que tiene el sistema RNAi son muy variadas. Por una parte el sistema funcionaría como un sistema de defensa contra virus, control de transposones o elementos génicos anómalos. Los propios virus han aprendido la lección y algunos de ellos expresan supresores del sistema RNAi, tratando de inhibir la respuesta defensiva. Un ejemplo de silenciamiento dirigido contra transposones, es la que se da en C. elegans donde normalmente se observa un control estricto de su actividad con la consiguiente estabilidad genómica. En cambio se ha comprobado que determinadas cepas deficientes en elementos del sistema RNAi muestran una gran movilidad de transposones [Tabara et al., Cell 99:123-32 (1999); Ketting et al., Cell 99:133-141 (1999)]. Por otro lado la formación de miRNA se ha revelado como un mecanismo importante en la regulación de la expresión génica endógena, y numerosos casos lo han puesto de manifiesto en diferentes organismos. Se sabe que en Drosophila, el silenciamiento se relaciona con mecanismos de regulación de la proliferación, muerte celular y el metabolismo de las grasas [Hay et al., Curr. Biology 13:790–795 (2003)]. Otros ejemplos serían el control de la asimetría neuronal izquierda/derecha en nemátodos [Johnston and Hobert., Nature 426:845-9 (2003)], la modulación de la diferenciación de la línea hematopoyética en mamíferos [Bartel et al., Science 303:83-6 (2004)], o el control del desarrollo de la hoja y la flor en plantas [Moussian et al., EMBO J.17:1799-809.(1998)]. Aunque probablemente la interferencia participe en otros procesos en los que aún no ha sido descrita, hay que anotar la estrecha relación que existe con los procesos de desarrollo y con los mecanismos de mantenimiento y diferenciación de las células madre, proceso que podría estar modulado de alguna forma por las proteínas Argonauta como sucede en Drosophila. Así, los ratones genosuprimidos (knock-out) para el gen Dicer1 no pueden procesar los miRNA, mueren muy pronto y carecen de células madre. Por tanto el sistema RNAi se revela como esencial para el mantenimiento de la población de células madre embrionarias por medio de mecanismos que no conocemos [Bernstein et al. Nat. Genet. 35:215-217 (2003)].
La siguiente cuestión es ¿podemos utilizar el sistema RNAi en nuestro beneficio? Los primeros intentos de silenciar genes específicos introduciendo en las células RNA de doble cadena funcionaron bien en C. elegans y Drosophila, pero fracasaron en células de mamíferos. La respuesta mediada por interferón ante la presencia de cualquier RNA de doble cadena mayor de 30 pares de bases bloqueaba de forma no específica toda la traducción de los mRNA [Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)]. Sin embargo, a partir de esa fecha, los siRNA de 19-22 pares de bases, que no provocan la respuesta mediada por interferón, se revelaron útiles para silenciar genes específicos en mamíferos. Desde entonces los resultados se han sucedido, sobre todo en experiencias in vitro, mostrando como siRNAs son capaces de silenciar el alelo oncogénico K-Ras (V12) en células tumorales, inhibiendo su tumorogenicidad [Brummelkamp et al., Cáncer Cell 2:243-247 (2002)]. También se han silenciado con éxito los mRNA procedentes del genoma del virus HIV-1 [Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-5 (2002)] o que codifican correceptores esenciales para la entrada de este virus en los linfocitos T, disminuyendo de forma efectiva el número de células infectadas [Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:183-8 (2003)]. Incluso el producto génico de la reorganización génica BCR/ABL, implicada en leucemias crónicas y agudas, se ha inhibido provocando apoptosis de las células leucémicas [Wilda et al., Oncogene 21:5716-5724 (2002)].
Saliendo del campo de aplicaciones terapéuticas, el sistema RNAi nos proporciona una potente herramienta para estudiar la función celular de determinados genes, que podemos silenciar a voluntad, incluso en transgénesis. La posibilidad de silenciar de forma permanente un gen determinado en células ES (células madre embrionarias) y luego en la línea germinal permite obtener ratones cuya progenie mantiene dicho silenciamiento [Carmell et al., Nat. Struct. Biol. 10:91-92.(2003)], reduciendo mucho el tiempo y el esfuerzo que ahora son necesarios para obtener líneas de ratones genosuprimidos. Mas lejos aún llegan los que ya aplican la interferencia como herramienta para identificar genes esenciales en procesos celulares. Así se ha hecho en los estudios realizados para determinar los genes cuya expresión sea indispensable para la división celular [Kittler et al., Nature 432:1036-1040 (2004)]. Esta técnica está basada en la generación de una colección de esiRNA (endoribonuclease-prepared short interfering RNA) con capacidad para inhibir 15497 genes humanos.
Por otra parte se han desarrollado técnicas para producir siRNA de forma económica, por ejemplo a partir de plásmidos diseñados para expresar una cadena sencilla de RNA con las secuencias sentido y antisentido separadas por un espaciador que permite que la cadena adopte la configuración en horquilla, susceptible de ser procesada por Dicer para dar los siRNA. También se ha ensayado la producción de RNA largos de doble cadena que pueden ser procesados in vitro por Dicer u otras RNAsas de tipo III para formar un cocktail de varios siRNA.
Pero el gran resultado con el que queremos terminar este artículo es el obtenido por un grupo de investigadores de los laboratorios farmacéuticos Alnylam, una nueva empresa dedicada fundamentalmente a las aplicaciones del sistema RNAi, cuyo lema corporativo es algo así como ?organizando una revolución en Biología para la salud humana? (www. alnylam.com). En este artículo se muestra, por primera vez, el silenciamiento terapéutico de un gen en ratones por administración intravenosa de siRNA modificados [Soutschek et al, Nature 432:173-178 (2004)]. El gen diana elegido fue el de la apolipoproteína-B, un componente esencial de la formación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que son las que aumentan en casos de hipercolesterolemia. Niveles séricos altos de Apo-B son, por tanto, un factor de riesgo cardiovascular. La idea (genial por su simplicidad) de los autores de este estudio fue utilizar una pequeña modificación química de los siRNA que los hacía más estables y, sobre todo, conjugar una molécula de colesterol en el extremo 3’ de la cadena sentido. Esto consiguió 1) unir la albúmina sérica, permitiendo una liberación muy lenta y retardando su eliminación por los riñones, y 2) dar la hidrofobicidad necesaria para atravesar la membrana celular y entrar en las células en múltiples órganos, como hígado, corazón, riñones y pulmones. Felizmente para los investigadores, la presencia de los siRNA en los hepatocitos y en el intestino, las principales células que sintetizan Apo-B, causó una fuerte reducción en la expresión de este gen y un significativo descenso en los niveles circulantes de Apo-B, LDL y colesterol total. El efecto fue específico e implicó la activación del sistema endógeno de silenciamiento génico. Este resultado muestra el primer caso de silenciamiento sistémico de un gen endógeno de mamífero por medio de un mecanismo mediado por el RNAi.
Es posible que todo esto sea contemplado en perspectiva histórica como el inicio de una revolución científica y terapéutica, pero aún hay que ser muy prudentes. Probablemente no existen precedentes de una transición tan rápida desde el descubrimiento de un nuevo mecanismo biológico a los primeros intentos de aplicación terapéutica (¡menos de seis años!). Es mucho lo que aún desconocemos de los sistemas de control génico mediados por RNAi. Por ejemplo, la cuestión de la dosificación puede ser esencial. El sistema RISC parece ser saturable, por lo que un exceso de siRNA podría bloquear su función normal, causando un descontrol en la expresión de muchos genes esenciales. También es preciso saber si existe un sistema de amplificación de la respuesta que la pudiese convertir en no específica, bloqueando la expresión de unos genes necesarios para el funcionamiento normal de la célula. Por último, será necesario afinar mucho el mecanismo de entrega ?a domicilio? de los siRNA, evitando en lo posible que penetre en células que no son diana. Pero a pesar de todo esto, las expectativas no pueden ser más excitantes...
Fuente: http://www.encuentro...ros101/rnai.htm
